El número anormal de cromosomas, o aneuploidía, es frecuente en embriones humanos. Es responsable de más de la mitad de todos los abortos espontáneos y es la principal causa de defectos congénitos. Además, se ha descrito que la aneuploidía también puede afectar la implantación embrionaria. Por lo tanto, seleccionar los embriones que tienen la mayor probabilidad de implantarse y desarrollarse en un bebé sano es uno de los pasos más importantes en el campo de la reproducción asistida. Los avances recientes en tecnologías genéticas, como la secuenciación de nueva generación (NGS), han permitido detectar la aneuploidía con mayor sensibilidad. La aplicación de esta técnica a biopsias de trofoectodermo, tomadas de embriones antes de la transferencia al útero, ha proporcionado información sobre el impacto clínico del estado cromosómico. Este proceso de selección de embriones para asegurar que tengan el número correcto de cromosomas y detectar cualquier anomalía estructural en los cromosomas se denomina prueba genética preimplantacional para aneuploidía (PGT-A). Requiere equipamiento específico y personal capacitado que incrementan los costos y riesgos, por lo que se buscan técnicas no invasivas como alternativa. Estos procedimientos no invasivos han sido explorados por algunos grupos que analizan el medio de cultivo usado donde el embrión se cultiva hasta el momento de la transferencia o la vitrificación. En la rutina diaria, este medio se descarta al finalizar el cultivo embrionario, pero se ha reportado que contiene trazas de ADN libre de células (cfDNA) embrionario que puede representar la carga genética del embrión. Sin embargo, en la actualidad existe una alta variabilidad en los resultados entre estudios, con un porcentaje de resultados concordantes entre el medio y la biopsia de trofoectodermo que oscila entre el 3,5 y el 85,7%. Por lo tanto, el objetivo principal de este proyecto es validar un nuevo método no invasivo para PGT-A (niPGT-A), basado en una recolección y análisis mejorados del medio de cultivo para alcanzar tasas más altas de sensibilidad y especificidad, y disminuir el efecto de algunas dificultades intrínsecas como el bajo aporte de cfDNA embrionario, el mosaicismo y la contaminación materna.
Los embriones humanos tienen tasas de aneuploidía más altas (20-80%) que otras especies. Una proporción considerable de estos embriones aneuploides tiene la capacidad de alcanzar el estadio de blastocisto. Sin embargo, dependiendo del tipo de aneuploidía, algunos no lograrán implantarse en el útero, mientras que otros se implantarán pero no podrán llevar a cabo el desarrollo embrionario temprano (aborto espontáneo) o, muy raramente, resultarán en niños nacidos vivos con anomalías específicas. Por lo tanto, es importante identificar los embriones aneuploides. La identificación de aneuploidías es especialmente importante en embriones de pacientes con mayor riesgo de aneuploidía, como aquellas con edad materna avanzada (AMA), fallo de implantación recurrente (RIF) o aborto recurrente (RM). La técnica PGT-A analiza el contenido cromosómico completo del embrión con alta sensibilidad y especificidad, pero requiere una biopsia invasiva para obtener material embrionario para el análisis genético. Por lo tanto, métodos no invasivos para reemplazar el método de prueba invasivo existente serían útiles para mejorar la seguridad materna y fetal. Recientemente, ha habido muchos avances en investigación en el campo de las pruebas genéticas. Se ha observado ADN libre de células (cfDNA) en el medio de cultivo embrionario usado. El origen del cfDNA en el estadio de blastocisto sigue siendo desconocido y esto ha impulsado a diferentes grupos de investigación a realizar análisis del medio de cultivo usado. Inicialmente se realizaron diversos estudios para detectar genes específicos asociados con enfermedades monogénicas (MTHFR9, HBA1/HBA210, SRY11). Recientemente, se ha desarrollado el PGT-A no invasivo, con resultados altamente variables en la tasa de concordancia (3,5%, 59,1% y 85,7%, 30,6%). El estado cromosómico del embrión a partir del ADN presente en el medio de cultivo usado se comparó con el obtenido siguiendo el protocolo estándar mediante biopsia de trofoectodermo. La diferencia en los resultados reportados puede estar relacionada con las diferentes metodologías aplicadas, ya que se utilizaron diferentes métodos de amplificación y detección (aCGH o NGS). Además, las tasas de concordancia se definieron de manera diferente en cada estudio; es decir, los resultados aneuploides en el medio de cultivo usado y la biopsia de trofoectodermo podían considerarse concordantes a pesar de no mostrar los mismos cromosomas aneuploides. El impacto de las condiciones de cultivo en la eficiencia del enfoque no invasivo se ha investigado exhaustivamente. Podría haber influencia de estos factores relevantes: contaminación externa del personal de laboratorio o equipamiento, contaminación con ADN materno de células de la granulosa (MCC) y umbral de mosaicismo para el diagnóstico. Para mejorar los resultados de los programas de FIV (fecundación in vitro), existe la necesidad de identificar el embrión con mayor potencial de implantación. El análisis cromosómico embrionario permite la selección de embriones euploides, que tienen una tasa de éxito de implantación más alta. El desarrollo de un protocolo de PGT-A no invasivo mejorará las metodologías actuales utilizadas para identificar esos embriones euploides, evitando el efecto perjudicial de la biopsia sobre el embrión y disminuyendo el costo económico. El objetivo principal del estudio actual es validar un nuevo método no invasivo para PGT-A (niPGT-A), basado en una recolección y análisis mejorados del medio de cultivo para alcanzar tasas más altas de sensibilidad y especificidad, y disminuir el efecto de algunas dificultades intrínsecas como el bajo aporte de cfDNA embrionario y la contaminación materna. El tamaño muestral estimado inicial calculado fue de 3245 embriones (cada embrión se considera como un sujeto en el estudio), considerando una tasa de abandono del 30%. Los datos exportados de las historias clínicas y documentos fuente serán debidamente codificados para proteger la información clínica y personal de los pacientes de acuerdo con la legislación vigente. Esta información será exportada a un formulario electrónico de reporte de caso (eCRF). Los datos serán agrupados y analizados en Igenomix en tres momentos del estudio: una vez que se hayan procesado 25 embriones de cada centro (para evaluar la implementación de la metodología), después de que se haya procesado el 30% de las muestras (como análisis interino para verificar los resultados) y al final del estudio para el análisis final incluyendo el seguimiento de los resultados clínicos (definidos según el Glosario Internacional sobre Infertilidad y Atención de la Fertilidad, 2017). Después del análisis interino, el tamaño muestral total fue recalculado en 2620 muestras, considerando una tasa de abandono del 5% de acuerdo con la tasa de abandono observada. Los resultados del análisis interino fueron publicados en Rubio et al., AJOG 2020.
PGT-A will be carried out following the usual clinical practice: Trophectoderm biopsy samples from blastocysts are analyzed by NGS to screen for numerical chromosomal abnormalities.
Non-invasive preimplantation genetic test for embryo aneuploidy analyzing the spent culture media where the embryo is incubated up to the time of vitrification. This media contains traces of embryonic cell-free DNA (cfDNA) that can represent the genetic load of the embryo.
Buenos Aires, Argentina